หลักการทำ PCR

ปฏิริยาลูกโซ่พอริเมอเรส (polymerase chain reaction) หรือ PCR เป็นเทคนิคที่ใช้เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายซึ่งอยู่ในสารลายรวมกับดีเอ็นอื่น โดยไม่จำเป็นต้องบทำให้ชิ้นดีเอ็นเอดังกล่าวบริสุทธิ์ก่อน สามารถแยกส่วนของดีเอ็นเอที่สนใจได้โดยไม่ต้องนำไปขยายเพิ่มปริมาณในเซลล์หรือนำไปโคลน การทำ PCR คือ การสังเคาระห์ดีเอ็นเอโดยใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอจะเกิดขึ้นได้จำเป็นต้องมีไพรเมอร์ด้วย จึงต้องมีไพรเมอร์ 2 ชนิดที่มีเบสคู่สมกับปลายทั้งสองด้านของดีเอ็นเอบริเวณที่ต้องการเพิ่มปริมาณ โดยไพรเมอร์จะเข้าเกาะกับดีเอ็นเอคนละสายและมีปลาย 3’ ในทิศทางเข้าหากัน ดังนั้น ข้อกำหนดในการทำ PCR คือ ต้องทรายลำดับเบสของดีเอ็นเอและบริเวณที่ต้องการเพิ่มปริมาณซึ่งอาจทราบลำดับเบสทั้งหมดหรือทรายเฉพาะส่วนปลายก็ได้ เพื่อการออกแบบสังเคราะห์ไพรเมอร์มาใช้ในปฏิกิริยาต่อไป บริเวณหรือชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เกิดการสังเคราะห์เพิ่มปริมาณขึ้น จะมีขนาดความยาวเท่ากับชิ้นดีเอ็นเอจากปลาย 5’ ของไพรเมอร์หนึ่งถึงปลาย 5’ ของไพรเมอร์อีกชนิดหนึ่งนั่นเอง

ไพรเมอร์ที่ใช้เป็นโอลิโกนิวคลีโอไทด์ ความยาวประมาณ 20-35 เบส วิธีทำ PCR คือ สกัดดีเอ็นเอจากเซลล์ นำมาใส่รวบกับไพรเมอร์ บัฟเฟอร์ ดีออกซีไรโบนิวคลีโอไซด์ไตรฟอสเฟส (dNTP) ทั้ง 4 ชนิด ทำให้ดีเอ็นเอต้นแบบแยกเป็นสายเดี่ยว (denaturation) โดยใช้ความร้อน แล้วลดอุณหภูมิลงอย่างรวดเร็ว เพื่อให้ไพรเมอร์ที่มีเบสคู่สมกับส่วนปลายของดีเอ็นเอเป้าหมายและมีปริมาณมากกว่าชิ้นดีเอ็นเออื่นๆมากมายเข้ามาจับคู่กับส่วนของดีเอ็นเอที่ต้องการ (annealing) ขั้นสุดท้ายจึงเปลี่ยนอุณหภูมิให้พอเหมาะกับการทำงานของเอนไซม์ดีเอ้นเอพอลิเมอเรส พร้อมทั้งใส่เอนไซม์ลงไปในปฏิกิริยา เอนไซม์จะทำหน้าที่สังเคราะห์ดีเอ้นเอต่อจากไพรเมอร์ (primer extension) โดยมีดีเอ็นเอเป้าหมายเดิมเป็นต้นแบบ เมื่อปฏิกิริยาดำเนินไปครบทั้ง 3 ขั้นตอ ดมเลกุลของดีเอ็นเอเป้าหมายจะเพิ่มขึ้นเป้น 2 เท่า เช่นจากเดิมมี 1 โมเลกุลจะเพิ่มเป็น 2 โมเลกุล ดังนั้นถ้าดำเนินปฏิกิรนิยาซ้ำกัน ( Denaturation-annealing-extension) หลายๆรอบ ปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายจะเพิ่มขึ้นจาก 1 เป็น 2,4,8… ไปเรื่อยๆจนถึง 2ⁿ เท่าเมื่อปฏิกิริยาผ่านไป n รอบ

การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในรอบแรก จะพบว่า ผลผลิตที่ได้ไม่ได้มีเฉพาะส่วนของดีเอ็นเอบริเวณที่เป็นเป้าหมายเท่านั้น แต่ได้โมเลกุลดีเอ็นเอที่มีสายหนึ่งยาวมากเพราะเป็นต้นแบบเดิม อีกสายหนึ่งที่เป็นคู่สมมีปลาย 5’ เริ่มต้นจากปลาย 5’ ของไพรเมอร์ที่ใช้ ส่วยปลาย 3’ ยาวออกไปนอกบริเวณที่ต้องการ ในรอบที่ 2 ยังคงได้ผลผลิตที่มีสายยาวมาก หรือมีปลาย 3’ ที่ยาวเกินส่วนที่ต้องการ จนถึงรอบที่ 3 จึงเริ่มมีโมเลกุลดีเอ็นเอที่มีขนดาเท่ากับเป้าหมายที่ต้องการ ซึ่งจะเพิ่มปริมาณขึ้นอย่างรวดเร็ว ส่วนโมเลกุลที่มีปลาย 3’ ยาว จะมีปริมาณเพิ่มขึ้นรอบละ 2 โมเลกุลเท่านั้น โดยโมเลกุลที่มีปลาย 3’ ดังกล่าวนี้สังเคราะห์มาจาดีเอ็นเอต้นแบบเริ่มต้นที่เป็นสายยาวเมื่อเปรียบเทียบกันพบว่า การสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดนรวมเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณรอบละ 2 เท่าแต่โมเลกุลที่มีปลาย 3’ ยาว เพิ่มขึ้นแบบสม่ำเสมอ 2 โมเลกุล ถ้าประสิทธิภาพของการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอสมบรูณ์ จะสามารถคำนวณปริมาณดีเอ็นเอที่เพิ่มขึ้นได้เมื่อเพิ่มปริมาณดีเอ้นเอครบ 30 รอบ ปริมาณดีเอ็นเอที่มีขนาดตามเป้าหมาย จะเพิ่มขึ้นประมาณ 1 พันล้านเท่า ขณะที่ดีเอ็นเอที่มีสายยาวมีเพียง 60 เท่า เมื่อนำผลผลิตที่ได้ไปตรวจสอบจึงพบเฉพาะดีเอ็นเอที่มีขนาดเท่ากับเป้าหมายเท่านั้น

การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอ อาศัยการทำงานของเอนไซม์ ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ถ้าใช้เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสจากแบคทีเรีย E.coli หรือจากเซลล์อื่น เมื่อทำให้ดีเอ็นเอเสียสภาพโดยใช้อุณหภูมิสูงประมาณ 95 องศาเซลเซียส เอนไซม์ก็จะเสียสภาพด้วยต้องเติมเอนไซม์ใหม่ลงไปในปฏิกิริยามุกรอบของการสังเคราะห์ ต่อมามีการค้นพย Tag  DNA polymerase จากแบคทีเรียในน้ำพุร้อน Thermus aquaticus เอนไซม์นี้สามารถทนความร้อนได้สูง ทำให้การดำเนินปฏิกิริยา PCR สะดวกขึ้น ไม่ต้องมีการเติมเอนไซม์ และสามารถประยุกต์ใช้กัยเครื่องอัตโนมัติได้โดยควบคุมอุณภูมิในแต่ละขั้นตอน ทำซ้ำ 30-40 รอบก็สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายได้เป็นล้านๆเท่าโดยใช้เวลาเพียง 3-4 ชั่วโมงเท่านั้น สำหรับอุณหภูมิที่ใช้ในแต่บะขั้นตอน ขั้นที่ 1 คือ ทำให้ดีเอ็นเอเสียสภาพ มักใช้ที่ 94-95 องศาเซลเซียสส่วนขั้นที่ 2 ทำให้ไพรเมอร์จับตัวกับดีเอ็นเอต้นแบบ จะอยู่ในช่วง 35-65 องศาเซลเซียส ขึ้นกับขนาดและองค์ประกอบของเบสและไพรเมอร์ที่ใช้ ทั้งนี้เพราะ ขนาดและองค์ประกอบของเบสมีผลต่ออุณหภูมิที่ใช้ในการแยกเกลียวคู่ให้เป็นสายเดี่ยว อุณหภูมิที่ใช้เพื่อทำให้ดีเอ็นเอเกลียงคู่แยกเป็นสายเดี่ยว  50 เปอร์เซ็นเรียกว่า Melting temperature หรือ Tm ในกรณีของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สามารถคำนวณค่า Tm โดยประมาณได้จาก temperature หรือ Tm ในกรณีของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สามารถคำนวณค่า Tm โดยประมาณจากการสูตร Tm = [4 x (C+G)] + [2 x (A+T)] โดย  G,C,A และ T คือจำนวนเบสแต่ละชนิดที่มีในสายโอลิโกนิวคลีโอไทด์นั้น ค่าที่ได้มีหน่วยเป็นองศาเซลเซียส อุณหภูมิสำหรับ annealing จะใช้ประมาณ Tm -5 องศาเซลเซียม ขั้นสุดท้าย คือ การสังเคราะห์ดีเอ็นเอต่อไพรเมอร์ จะใช้อุณภูมิที่เอนไซม์ทำงานได้ดีที่สุด สำหรับ Tag polymerase คือ 72 องศาเซลเซียสว

เมื่อทราบลำดับเบสของยีนใดๆแล้ว สามารถสังเคราะห์ไพรเมอร์ 2  ชนิดสำหรับส่วนหัวและส่วนท้ายของยีนนั้น นำมาใช้เพิ่มปริมาณส่วนของยีนดังกล่าวเพื่อแยกยีนนั้นจากจีโนมหรือจากดีเอ็นเอโดยรวมได้ โดยอาจใช้เทคนิค PCR ในการแยกส่วนของยีนใด ๆ ที่ทราบลำดับเบสเพื่อมาใช้โคลนยีน ใช้เป็นโพรบเพื่อตรวจหายีนที่มีความสัมพันธ์กัน ใช้ตรวจพอลิเมอร์ฟิซึมในสิ่งมีชีวิต ใช้ในการตรวจสอบจีโนไทป์ ตรวจหาเชื้อโรคที่เกิดกับคน สัตว์ หรือพืช เป็นต้น

เนื่องจากเทคนิค PCR เป็นเทคนิคที่มีความไว (sensitivity) สูง สามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป็นล้านๆ เท่าได้อย่างรวดเร็ว ใช้ดีเอ็นเอเริ่มต้นเพีลงเล็กน้อยก็สามารถตรวงสอบได้ ดังนั้นจึงต้องระมัดระวังการปนเปื้อนของดีเอ็นเอจากภายนอก เช่น จากอากาศ ผิวหนัง ผม เป็นต้น เพื่อป้องกันปัญหาดังกล่าวจึงควรทำ PCR ในบริเวณที่สะอาดไม่ปะปนกับการทดลองอื่น สวมถุงมือ ในการปฏิบัติงาน และมีหลอดควบคุมที่ไม่มีดีเอ็นเอ (Negative control) ในการทดลองทุกครั้ง การปนเปื้อนของดีเอ็นเอจากภายนอกนี้เป็นปัญหาที่สำคัญมากในการทดลองเพื่อตรวจหาดีเอ็นเอที่มีปริมาณน้อย ๆ เช่น ตรวจดีเอ็นเอของแบคทีเรียจากอาหาร ดีเอ็นเอของแบคทีเรียหรือไวรัสที่ทำให้เกิดโรคในคน เป็นต้น ในการทำ PCR ต้องใช้สารเคมีต่างๆดังนี้

1. บัฟเฟอร์ สำหรับทำปฏิกิริยาซึ่งมักจะมาพร้อมกับเอนไซม์ Tag  polymerase โดยมีความเข้มข้นเป็น 10 เท่าของที่ใช้จริง ( 10x buffer ) ซึ่งจะใส่ในปริมาณ 1 ใน 10 ของปริมาตรรวมของปฏิกิริยา
2. dNTP ประกกอบด้วย  dATP , dCTP , dGTP , dTTP  ความเข้มข้นอย่างละ 2 มิลลิโมลาร์ โดยอาจซื้อมาสำเร็จรูปหรือซื้อมาแต่ละชนิด แล้วจึงนำมารวมกันให้ได้ความเข้มข้นตามที่ต้องการ ในปฏิกิริยาจะใส่ในปริมาณ 1 ใน 10 ของปริมาตรรวม เพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายเป้นชนิดละ 200 ไมโครโมลาร์
3. ไพรเมอร์ ที่นิยมใช้คือโอลิโกนิวคลีโอไทด์ขนาด 20-24 นิวคลีโอไทด์ มีองค์ประกอบของเบส  G และ C อยู่ระหว่าง 40-60 เปอร์เซ็น โดยไพรเมอร์ทั้ง 2 ชนิดที่ใช้คู่กันควรมีส่วนประกอบของ G+C เท่ากัน เพื่อให้ค่า  Tm  เท่ากันหรือใกล้เคียงกัน และไม่ควรใช้ไพรเมอร์ที่มีลักษณะปลายทั้ง 2 ข้างเป็นคู่สมกัน (palindrome sequence) ทั้งภายในไพรเมอร์เดียวกันและระหว่างไพรเมอร์ทั้ง 2 ชนิดที่ใช้คู่กัน แต่ในบางกรณีก็พบว่าอาจจะใช้ไพรเมอร์ที่มีลักษณะไม่เหมาะสมดังกล่าวได้บ้าง การออกแบบไพรเมอร์อาจทำได้โดยดูจากลำดับเบสของดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มปริมาณโดยตรง หรือ ใช้โปรแกรมสำเร็จรูปก็ได้ เมื่อสังเคราะห์ไพรเมอร์เรียบร้อยแล้ว จึงนำมาละลายในน้ำหรือ TE buffer ให้มีความเข้มข้น 5 พิโคต่อไมโครลิตร ( หรือ 5 ไมโครโมลาร์) ปริมาณที่ใช้ในปฏิกิริยา คือ ให้ความเข้มข้นสุดท้ายเป็น 0.1-2.0 ไมโครโมลาร์
4. ดีเอ็นเอเป้าหมาย ใช้ได้ทั้งดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีและดีเอ็นเอที่มีคุณภาไม่ดีนัก เช่น ดีเอ็นเอจากหยดเลือด เนื้อเยื่อที่เก็บในพาราฟิน เป็นต้น แต่ถ้าใช้ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีก็จะได้ผลผลิตมากกว่า ปริมาณดีเอ็นเอใช้ได้ตั้งแต่ 5-500 นาโนกรัม โดยทั่วไปนิยมใช้อยู่ในช่วง 10-50 นาโนกรัมต่อปฏิกิริยา
5. แมกนีเซียมคลอไลด์ ซึ่งอาจรวมอยู่ในบัฟเฟอร์ก็ได้แต่ส่วนใหญ่แยกต่างหกาเพื่อให้ปรับใช้ได้ในปริมาณที่เหมาะสมกับดีเอ็นเอแต่ละชนิด เนื่องจากแมกนีเซียมไออนเป็นส่วนสำคัญในการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส และ ทีรายงานว่าความเข้มข้นของแมกนีเซียมไอออนมีผลต่อปฏิกิริยามกา ดังนั้น ในการทดลองกับตัวอย่างชนิดใหม่ที่ยังไม่มีรายงานมาก่อน จึงควรทดลองปรับเปลี่ยนความเข้มข้นของแมกนีเซียมคลอไรด์ก่อนเพื่อเบือกความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุด ความเข้มข้นของแมกนีเซียมที่ใช้ในปฏิกิริยาคือ 1.5-10 มิลลิโมลาร์
6. เอนไซม์ เนื่องจากขั้นตอนในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอโดยเทคนิค PCR ต้องมีการทำให้ดีเอ็นเอเสียสภาพด้วยความร้อน เอนไซม์ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่ใช้ จึงเลือกใช้เอนไซม์ทนความร้อน (thermostable DNA polymerase ) เอนไซม์ชนิดแรกแยกได้จากแบคทีเรีย Thermus aquaticus VT1 ทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 70-80 องศาเซลเซียส มีกิจกรรมที่สูงสุดได้ที่ pH 7.3-8.3 ชนิดที่ 2 แยกได้จากแบคที่เรียเดียวกันเป็นชนิดที่มีการใช้กันมาก รู้จักกันในชื่อ Tag  polymerase ทำงานได้ดีที่อุณหภูมิ 70-80 องศาเซลเซียสสำหรับเอนไซม์ Tag  polymerase มักอยู่ในสารละลายที่มีความเข้มข้น 5 ยูนิตต่อไมโครลิตร และใช้ในปฏิกิริยา 2.5-5 ยูนิตต่อปฏิกิริยา 100 ไมโครลิตร ต่อมาสามารถแยกเอนไซม์ได้อีกหลายชนิดจากแบคทีเรียต่างๆโดยทุกชนิดที่แยกได้ประกอบด้วยพอลิเปปไทด์เดียว (Monomer ) ขนาดอยู่ระหว่าง 61-100 กิโลดาลตัน ความแตกต่างของเอนไซม์แต่ละชนิดคือ การมีคุณสมบัตรตัดดีเอ็นเอจากปลาย (exonuclease activity) เพราะเอนไซม์ที่สามารถตัดดีเอ็นเอจากปลาย 3’ (3’ ไป  5’ exonuclease ) จะสามารถกำจัดนิวคลีโอไทด์ที่สังเคราะห์ผิดพลาดหรือตรวจสอบความถูกต้องได้ (proofreading)